Molekularbiologie:

• Planung und Herstellung von GFP- Fusionsprotein-Konstrukten
• PCR-Methoden
• Herstellung von gereinigten Plasmidvektoren für Transfektionen.

Zellkultur:

Primärkulturen:

• Hirnschnitte des Hippocampus und des Neocortex (Stoppini-Methode)
• Neuronale Mikrokulturen (d.h. einzelne dissoziierte Neurone auf Glia-Inseln, Bild rechts)
• Transfektion mittels Calciumphosphat- Präzipitation
• Biolistische Transfektion von Hirnschnitten mit der "Genegun"
• Planung und Herstellung von GFP- Fusionsprotein-Konstrukten.

Sekundärkulturen:

• COS 7 Zellen, PC 12 Zellen, etc.
• Transfektion mittels Polyethylenimine

"Genegun" zur biolistischen Transfektion von Neuronen in Gehirnschnitten

Fluoreszenzaufnahme der Plasmamembranlokalisation eines GFP markierten TrkB Tyrosinkinaserezeptors in einer sekundären Zellinie (PC12 Zellen).

Sogenannte Mikrokultur eines einzelnen oder eines Paares hippokampaler Neurone auf einer darunter liegenden Glia-Insel. Elektrophysiologische Untersuchungen an solchen Kulturen erlauben die Feinanalyse der synaptischen Signalverarbeitung.

Elektrophysiologie:

Meßaufbau zur gleichzeitigen Patch-clamp Ableitung und Fluoreszenz-Videomikroskopie an Gehirnschnitten

• Patch-clamp Ableitungen (Ganzzell,- Einzelkanal, etc.)
• Analyse synaptischer Miniaturströme
• Messung transmitteraktivierter Ionenkanäle mit
  schnellen Perfusionssystemen (z.B. Druckapplikation,
  Iontophorese)

Mikroskopie und Bildverarbeitung:

Visualisierung von dendritischen Dornen in einer GFP-transfizierten, Zelle des Hippocampus. Die rot angefärbten (FM 4-64-Färbung) Strukturen sind es sich um gegenüberliegende präsynaptische Terminalien.

• Konfokale Mikroskopie
• Time-lapse Videomikroskopie dynamischer Prozesse
  GFP-markierter Proteine in lebenden Neuronen
• Videomikroskopische Untersuchung der Ausschüttung
  GFP-markierter sekretorischer Proteine
• Analyse der präsynaptischen Funktionalität durch
  kinetische Studien der Aufnahme und
  Wiederfreisetzung von synaptischen
  Lebend-Farbstoffen (FM 1-43, FM 4-64).
• Immuncytochemische Mehrfachfärbungen.
• Analyse dendritischer Verzweigungen und "Spines" in
  GFP-expremierenden Neuronen.

Neuron des Hippocampus der Ratte nach Transfektion mit einem BDNF-GFP Expressionsplasmid. Bei der punktuellen Fluoreszenz in den Dendriten handelt es sich um BDNF-GFP enthaltende sekretorische Vesikel.

Segment eines Dendriten eines BDNF-GFP exprimierenden Neurons. Von links nach rechts ist derselbe Bildausschnitt dargestellt und zeigt die Fluoreszenz des BDNF-GFP (grün) die rote Co-Färbung mit dem synaptischen Marker FM 4-64, in blau den Nachweis eines dendritischen Proteins (MAP2) und ganz rechts die Überlagerungen der 3 Farbkanäle.